质粒设计

从ExpiCHO细胞中成功表达和纯化包膜蛋白是一个多步骤过程，始于质粒设计和细菌转化。这些步骤对于在ExpiCHO细胞中实现高效的蛋白质表达至关重要，它们确保蛋白质的正确折叠、引入用于纯化和可视化的标签，以及足够的质粒用于细胞转染。

如果转染操作正确，ExpiCHO细胞上清液中应含有可溶性表达蛋白，该蛋白可通过结合Ni-NTA磁珠并经流式柱纯化。纯化的蛋白组分可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行蛋白质分析，随后进行免疫印迹（Western blotting）或考马斯亮蓝染色。纯化的蛋白组分可根据需要进行缓冲液交换和浓缩，用于后续实验。

质粒设计

我们设计建立一种高效的质粒设计方法。用于生产三聚体融合前病毒刺突蛋白胞外结构域。从数据库获得基因序列并且应该针对哺乳动物细胞进行密码子优化，以确保高效的蛋白质表达。密码子优化可通过质粒订购服务获得。

基因插入片段（刺突蛋白胞外结构域序列）应起始于普遍存在的疏水性N端信号肽序列之后，终止于同样普遍存在的跨膜结构域之前。这些特征可以通过诸如SignalP之类的网络服务器进行识别

还应添加一个 N 端 5′ 侧翼延伸，其中包含 BamHI 限制性位点 (GGATCC)、Kozak 共识序列 (GCCACC) 和 μ-磷酸酶衍生的信号肽 (MGILPSPGMPALLSLVSLLSVLLMGCVAETGT)，以确保细胞外蛋白质分泌（图）。

C 端 3′ 侧翼延伸，其中包含：

TEV 切割位点 (GSGRENLYFQG)

T4 折叠三聚体基序 (GGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)

Avi 标签 (GSGGLNDIFEAQKIEWHE)

8× His 标签 (GSGHHHHHHHH)

终止密码子 (TAA)

EcoRI 限制性位点 (GAATTC)

插入片段应订购pcDNA3.1+或同等规格的转染级质粒（90% ± 5%超螺旋，内毒素≤0.1 EU/µg）。

Expression and Purification of SARS-related Spike Glycoproteins for Cryo-EM Analysis Francesca R. Hills, Fátima Jorge, Laura N. Burga, Mihnea Bostina. First published: 08 March 2025 https://doi.org/10.1002/cpz1.70115.