tau蛋白寡聚体制备

重组tau蛋白的过表达和纯化

使用单体产品：

http://www.mabioway.com/aercihaimobing-ad-/14625.html

Cat. No. MAG-1190，Recombinant Tau-441 (2N4R) Wild-Type Monomers (MAG-1190)

Tau蛋白寡聚体制备方案1:

重组Tau蛋白寡聚化裂解缓冲液

1.500 毫升5M NaCl：在500毫升的最终体积中加入146.1克NaCl。

2.500 毫升1M Na2HPO4：在500毫升的最终体积中加入70.98克Na2HPO4 。

3.500 毫升1M NaH2PO4：在500毫升的最终体积中加入78克NaH2PO4 。

4.75 毫升1M Na3PO4缓冲液（pH 7.2）：加入 51.3 毫升 1M Na2HPO4和23.7毫升1M NaH2PO4。

5.1.5L 低聚物透析缓冲液：加入 30 ml 5 M NaCl、75 ml 1 M NaPO4缓冲液（pH 7.2），并用 ddH2O加满。储存于4 °C。

6.30% H₂O₂ 。储存于4°C 。

7.抗tau蛋白一抗、蛋白质印迹试剂和设备。

重组Tau单体的寡聚化

1.向重组的tau单体蛋白中加入TCEP，使其最终浓度达到 0.287mg/ml。

2.加入EDTA至最终浓度为5mM。

3.在37°C下孵育1小时。

4.用超纯蒸馏水清洗20K MWCO蛋白质浓缩器，将洗脱液转移到柱中，并在4°C下以40,000×g离心，用寡聚化缓冲液进行缓冲液交换（将约5毫升与47毫升寡聚化缓冲液混合，并进行多次离心——每次持续 20分钟——直到收集到约50毫升流出液和1.5-2毫升浓缩液）。

5.收集滤液，加入30%H2O2，使最终浓度达到1mM。

6.在室温下持续旋转孵育20小时，以引入二硫键。

7.再次用寡聚化缓冲液透析，（清洗蛋白浓缩器后，将上一步的洗脱液与寡聚化缓冲液混合，并进行多次离心。我们希望收集 50 ml 流出液和 1-2 ml 柱上样品。调整最终从柱上收集的体积可能会导致样品浓度更高或更低。但是，我们不建议收集少于 1 ml 的体积，因为在最后一步很难预测通过过滤器的体积，这可能会导致蛋白质损失。）。

8.使用nanodrop分光光度计测定 280 nm 处的吸光度来确定 tau蛋白浓度（使用 45,900 kDa 的分子量和 7450 cm−1m −1的消光系数。空白测量使用寡聚化缓冲液。），并通过Western Blot可视化 tau寡聚体（图 3）（为了进行Western Blot可视化，将7μg样品与不含还原剂的上样缓冲液混合，并在100 °C下煮沸5分钟。之所以不添加还原剂，是因为还原剂会破坏二硫键，导致我们只能观察到单体而无法观察到由二硫键形成的高阶寡聚体。按照常规Western Blot流程，将样品上样至10% Tris-乙酸凝胶，然后转移至硝酸纤维素膜上。免疫印迹实验中，我们使用了根据制造商说明稀释至最终浓度的抗tau抗体。显色后，您应该能够检测到分子量大于100 kDa的条带，这些条带代表tau寡聚体，分子量约为50 kDa的条带代表单体形式）。

Tau蛋白寡聚体制备方案2:

将重组tau蛋白（Cat. No. MAG-1190，Recombinant Tau-441 (2N4R) Wild-Type Monomers）tau-441(2N4R) 45.9 kDa；用8M尿素处理以获得单体tau蛋白，然后在pH 7.4的1×PBS缓冲液中透析过夜。用PBS将样品浓度调整至1 mg/ml，并将tau单体（溶于PBS）分装后保存于-20°C。将300 μl tau蛋白原液（1 mg/ml）与700 μl 1×PBS混合，得到tau寡聚体，最终浓度为0.3 mg/ml。然后将样品在室温下于轨道摇床上孵育 1 小时（Lasagna-Reeves 等，2010；Lasagna-Reeves 等，2011c）。所得 tau 寡聚体通过快速蛋白液相色谱法（Superdex 200柱；GE Healthcare）纯化。

TOMA 特异性识别 tau 寡聚体

利用源自全长人tau蛋白的tau寡聚体开发了TOMA抗体，其方法与之前报道的多克隆抗tau寡聚体抗体(T22)的制备方法相同（Lasagna-Reeves等，2012a）。通过Western blot、ELISA和斑点印迹分析（图1）证实了该抗体的特异性，结果表明，该新型抗体主要识别tau蛋白的二聚体和三聚体，而不与单体tau蛋白或其他淀粉样蛋白的寡聚体发生反应，例如6E10识别的Aβ或4D6识别的α-突触核蛋白（图1 A–D）。TOMA是一种IgG2a抗体，对tau寡聚体具有高亲和力（解离常数Kd= 3.1 × 10^-7），该亲和力通过ELISA稀释法测定。通过使用 AD 人脑匀浆的蛋白质印迹法也证实了该抗体对 tau 寡聚体的特异性。

TOMA抗体的特异性。A ，体外形成的tau蛋白、α-突触核蛋白和Aβ聚集体（每泳道2 μg蛋白）的Western blot分析，使用TOMA抗体进行检测。B ，使用与A相同的膜，用序列特异性抗体进行复染。TOMA特异性识别tau寡聚体，但不识别其他淀粉样蛋白的寡聚体或单体tau蛋白（红色方框）。C ，重组tau单体、寡聚体和原纤维；重组α-突触核蛋白；以及Aβ42寡聚体的代表性斑点印迹分析，分别使用Tau-5、TOMA、4D6、6E10和抗小鼠IgG进行检测。D ， ELISA分析证实TOMA对单体tau蛋白没有反应性，对体外制备的tau原纤维（50 ng/孔）也没有显著的反应性。即使在灵敏度较高的ELISA分析中，TOMA也无法识别其他淀粉样蛋白（如Aβ或α-突触核蛋白）的寡聚体。E图显示了使用TOMA（tau寡聚体特异性抗体）和Tau-5（可识别所有形式的tau蛋白）对AD脑组织PBS可溶性组分进行Western blot分析的结果。TOMA特异性地检测到了对应于tau寡聚体的条带（红色括号），但无法识别AD脑组织中含量丰富的单体tau蛋白（黑色箭头），这由Tau-5的免疫反应性所证实（每泳道25 μg蛋白）。

Tau蛋白寡聚体制备方案3:

Aβ低聚物的制备

将1 mg冻干的Aβ42肽溶于1.5 mL 50%乙腈溶液（乙腈：水）中，分成三份，每份500 μL（约0.3 mg），再次干燥。取每管0.3 mg肽溶于200 μL六氟异丙醇（HFIP）中，室温孵育10-20分钟。向该溶液中加入700 μL双蒸水。用带孔盖密封试管，使HFIP挥发。然后在通风橱中，用涂有聚四氟乙烯的微型搅拌子以500 rpm的转速搅拌36小时。

重组tau寡聚体的制备

重组全长人tau蛋白（tau 441，2N4R，45.9 kDa）在大肠杆菌系统中表达，并按照先前描述的方法从该系统中纯化。然后，按照我们已发表的方案将该重组tau蛋白寡聚化。简而言之，用8M尿素处理tau蛋白以获得单体。将等分试样储存于-20°C。然后将单体tau蛋白透析至1×PBS缓冲液中，并通过添加1×PBS缓冲液调整最终体积，使tau蛋白的最终浓度为0.3 mg/mL。向其中加入稀释度为1:140 (w/w)的Aβ42寡聚体作为种子，并将样品在室温下于摇床上孵育1小时。该寡聚体制备物通过快速蛋白液相色谱(FPLC)纯化，并用于制备另一批新鲜的单体tau蛋白。为了排除任何残留的Aβ42寡聚体种子，对另一批（第三次）寡聚体制备物重复了上述步骤。经过三轮tau寡聚体制备后，最终样品中未检测到任何Aβ42寡聚体（种子），因为Aβ42 / tau比值估计小于1:2470000。该最终的tau寡聚体制备物用于生成标准曲线，并作为所有脑脊液样本ELISA检测的阳性对照。