预成型原纤维—细胞和动物模型指南

什么是预成纤维？

蛋白质聚集是多种神经退行性疾病的核心病理特征，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、额颞叶痴呆（FTD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、进行性核上性麻痹（PSP）、皮质基底节变性、多系统萎缩（MSA）和亨廷顿病（HD）。

在病理条件下，诸如tau蛋白、β-淀粉样蛋白、α-突触核蛋白、TDP-43和亨廷顿蛋白等蛋白质会从其天然状态错误折叠，并组装成有毒的寡聚体和纤维状结构。这种错误折叠是通过成核聚合或“种子”过程发生的，其中聚集体通过单体的逐步添加而生长。 

一旦团簇膨胀到超过临界尺寸——从小的可溶性寡聚体到高度有序的富含β折叠的纤维状聚集体——进一步的单体添加在能量上就变得有利。这一过程驱动有毒聚集体的形成，这些聚集体是多种神经退行性疾病中 受累神经元和胶质细胞内病理包涵体的主要成分。

在这些聚集体中，纤维状形式代表了一种特别动态且具有致病性的蛋白质聚集状态。纤维通过募集可溶性单体蛋白而快速延伸，这些单体蛋白作为模板驱动进一步聚集。重要的是，成熟的纤维并非静止的最终产物；相反，它们可以自发断裂成更短的纤维片段，这些片段保留了作为“种子”的能力，能够诱导受体细胞内源性蛋白质的从头聚集。这些种子可以通过多种机制在细胞间传播，包括：  

a)       胞吐作用 

b)       内吞作用

c)       隧道纳米管

d)       突触传递

这种自我传播的朊病毒样行为现在被认为是多种神经退行性疾病中病理在相互连接的大脑区域逐渐扩散的统一机制。

预成型纤维（PFFs）是体外生成的纤维状组装体，能够在细胞和动物模型中重现疾病相关聚集体的结构和生化特性。PFFs具有强大的种子活性，使其能够募集内源性可溶性蛋白，并在引入生物系统后诱导细胞内聚集体的形成。 

因此，基于 PFF 的模型重现了人类神经退行性病理的关键方面，包括疾病相关蛋白质的错误折叠、播种、聚集和传播，以及下游神经毒性和神经炎症。

开发准确、可靠且生理相关的疾病模型对于阐明驱动神经退行性疾病的分子机制、评估治疗干预措施的有效性以及评价候选药物的安全性至关重要。与依赖基因过表达、化学诱导或物理损伤的传统方法相比，PFF诱导模型具有以下显著优势：

a)       与需要较长成熟期的转基因动物模型相比，神经退行性过程的诱导速度更快。

b)       更忠实地再现人类疾病中观察到的自然发生的播种和传播过程。 

c)       可控地诱导具有明确时空特征的病理。 

d)       与培育转基因动物相比，建立和维护成本更低。

e)       PFF 的形成可以标准化和验证（例如通过硫黄素 T 测定、透射电子显微镜或原子力显微镜），从而保证质量和结构的一致性。

f)        PFF 诱导可以与转基因或毒素诱导模型相结合，以更好地重现疾病的分子和行为方面。

g)       适用于体外和体内系统，从培养的神经元和 iPSC 衍生细胞到动物研究。

h)       因此，基于 PFF 的建模代表了一种强大而创新的策略，可用于研究神经退行性疾病中蛋白质聚集的起始、传播和后果。

该表比较了用于模拟各种神经退行性疾病的特征，包括蛋白质类型、模拟疾病、蛋白质同工型/突变、原纤维形态、播种效率和细胞靶点。

目前使用哪些细胞模型来研究PFF诱导的细胞播散和扩散？

PFF 的细胞模型通常是指利用 PFF 诱导内源性蛋白质聚集，从而模拟神经退行性疾病病理的体外细胞系统（Volpicelli-Daley，2014）。PFF 在细胞模型中的形成和增殖通常经历以下步骤： 

a)       首先将重组单体组装成原纤维，其结构类似于病理包涵体中发现的原纤维。 

b)       然后将 PFF 超声处理成更短的片段，并应用于培养细胞。 

c)       在培养的神经元和胶质细胞内，PFF 会引发细胞内天然聚集蛋白的聚集。 

d)       根据 PFF 及其旨在模拟的病理，这种聚集可能导致翻译后修饰（如磷酸化）和形成类似于疾病状态下所见的致病性包涵体。

神经退行性疾病中蛋白质聚集的机制。

例如，在帕金森病中，PFF 细胞模型被广泛使用，因为它们不依赖于 α-突触核蛋白的过度表达；相反，它们在生理蛋白质水平上引发聚集，使它们更接近人类的状况。 

这些模型可用于研究α-突触核蛋白聚集、传播及相关细胞功能障碍的机制。常用的细胞系包括：  

a)       SH-SY5Y 人类神经母细胞瘤细胞 

b)       从啮齿动物中分离出的原代神经元 

c)       人类诱导多能干细胞衍生的神经元

这些模型中形成的病理聚集体是稳定的，可以通过细胞传代进行传播，重现突触核蛋白病的关键特征。 

目前，源自小鼠或人类的α-突触核蛋白原纤维（包括野生型和突变型）可在多种缓冲条件下生成。人类α-突触核蛋白原纤维也可通过“种子”反应制备，即加入帕金森病患者样本以促进致病构象的扩增（Wu，2024）。这些模型在研究细胞摄取途径、炎症反应以及测试聚集抑制剂方面发挥了重要作用。它们也被广泛应用于细胞和动物模型中，以研究帕金森病机制并支持全球药物研发工作。

然而，PFF制备或超声处理参数的差异会影响原纤维的致病性，这是该系统的一个局限性。尽管存在这种潜在的局限性，基于PFF的细胞模型仍然是研究α-突触核蛋白错误折叠及其在神经退行性疾病研究中的细胞后果的有力工具。 

为了评估 PFF 诱导的播种和扩散，我们采用了多种措施来评估疾病相关细胞模型中病理原纤维传播的机制、动力学和调节因素。

该表比较了用于评估 PFF 诱导的蛋白质聚集、传播和毒性的实验读数，包括细胞内聚集体形成、原纤维摄取和原纤维化、细胞活力、播种能力、细胞间传播、病理共定位和共聚焦成像。

目前使用哪些动物模型来模拟PFF诱导的播散和扩散？

在神经退行性疾病的动物模型中，PFFs 常被用来模拟疾病中发生的蛋白质错误折叠、播种和扩散的自然过程，从而生成更符合生理的病理模型。

PFFs由tau蛋白或α-突触核蛋白等致病蛋白在体外生成，能够复制体内神经退行性疾病的关键特征，包括：

a)       更准确地预测致病蛋白聚集体在大脑中的播散和扩散。

b)       与传统的转基因或毒素诱导动物模型相比，分子病理的诱导速度更快、可重复性更高。

c)       更精确地控制病理发生的时机、地点和程度。

d)       更通用、更经济的方法，适用于多种蛋白质病。

e)       为测试旨在抑制体内聚集、扩散或下游神经退行性变的候选疗法提供了一个强大的平台。 

总的来说，在动物模型中使用 PFF 提供了一种强大而灵活的方法，可以忠实地复制神经退行性疾病的分子和病理方面，并进行时间和空间控制，从而促进机制研究和治疗开发。

用于研究 PFF 诱导的播散和扩散的动物模型主要涉及啮齿动物，特别是小鼠和大鼠，其主要模型和特征如下：

过表达人类蛋白质的转基因小鼠： 

这些小鼠在注射PFF后会出现加速性蛋白病变以及行为或运动障碍。常用模型包括： 

a)       M83 小鼠过表达携带 A53T 突变的人类 α-突触核蛋白，用于构建帕金森病模型。

b)       PS19 小鼠表达携带 P301S 突变的人类 Tau 蛋白，用于构建 tau 蛋白病模型。

c)       APP/PS1 小鼠表达嵌合小鼠/人类淀粉样前体蛋白 (Mo/HuAPP695swe) 和突变人类早老素 1 (PS1-dE9)，两者均靶向神经元，用于 AD 模型。  

表达人类突变亨廷顿蛋白的转基因小鼠也被用于亨廷顿病模型研究。

野生型（非转基因）啮齿动物： 

野生型小鼠或大鼠也可注射重组PFFs（α-突触核蛋白、tau蛋白、β-淀粉样蛋白），以诱导内源性蛋白聚集和病理变化，而无需转基因过表达。该模型可用于研究正常生理蛋白在细胞播种和增殖中的作用。 

我们采用立体定向技术，将超声处理的重组人 tau PFF 或脑提取物输送到 PS19 小鼠的海马体和上覆皮层，与未注射的 PS19 小鼠中观察到的自发性、年龄依赖性发展相比，有助于加速和同步该模型中 tau 病理的发生。 

作为一家临床前神经科学 CRO，我们还提供帕金森病的 α-突触核蛋白 PFF 小鼠模型，方法是将重组人 α-突触核蛋白 PFF 立体定位接种到 M83 转基因小鼠中，或将鼠 α-突触核蛋白接种到野生型 (B6-C3H) 小鼠中。

突触核蛋白 PFF 动物模型构建的一般方案。

这些动物模型具有高度可重复性，tau蛋白和α-突触核蛋白PFF接种的成功率接近100%。PFF接种和扩散的有效性也可以通过多种体内结果指标进行验证，包括：

a)       组织病理学分析：免疫组织化学或多重免疫荧光法检测脑区中种子蛋白聚集体和疾病相关的翻译后修饰随时间的变化。

b)       生化分析：提取和Western blot或ELISA定量不溶性聚集蛋白组分。

c)       空间和时间扩散：绘制 PFF 注射后沿神经解剖通路病理扩散图，以评估传播情况。

d)       行为表型分析：对与模拟疾病相关的运动、认知和感觉功能进行评估，以将病理与功能缺陷联系起来。

e)       神经退行性变和脑萎缩：通过体积磁共振成像 (MRI)或对受影响脑区突触标记物进行染色来量化神经元丢失和脑萎缩。

f)        体内成像：利用报告动物或成像示踪剂监测聚集体的形成和纵向扩散。

g)       体液生物标志物：在PFF小鼠模型的血浆和脑脊液中检测到了神经退行性生物标志物水平升高，例如神经丝轻链（NfL）和促炎细胞因子（IL-1β和TNF-α）。这些生物标志物反映了与PFF诱导的病理相关的细胞损伤。