验证用于研究的抗体不仅仅是简单地在蛋白质印迹上运行一些细胞裂解物并检查是否可以检测到正确大小的条带。相反，强大的抗体验证采用多种测试策略，结合起来证明与目标蛋白质的特异性结合，而没有任何脱靶效应。尽管许多抗体制造商在将产品推向市场之前会进行广泛的验证，但研究人员在自己的实验室中确认抗体的性能至关重要。
结合验证策略增强对抗体性能的信心
经过充分验证的抗体，通过实施多种方法，已被证明能够以特定方式识别其声称的靶标。有效的策略包括二元验证，即针对已知表达或不表达目的蛋白质的样本对抗体进行测试，以及范围验证，涉及使用表现出高、中和低水平靶标的样本。理想情况下，蛋白质表达应通过原位杂交或质谱 (MS) 等正交方法进行验证，同时可以通过比较识别相同表位上不同的、非重叠表位的两种或多种抗体的性能来进一步加强测试数据。目标。
CRISPR/Cas9 的发现以及随后在主流生物学中的应用为确定真正的抗体特异性提供了一种强大的手段。“敲除 (KO) 细胞和细胞裂解物是抗体生成流程中有价值的阴性对照，可以明确确认抗体特异性，特别是在感兴趣的应用中进行时，。“然而，这个过程的关键步骤之一在于确认 KO 细胞系本身的有效性。这可以通过测序来实现，然后可以使用已建立的抗体试剂对细胞系进行蛋白质组学验证。如果此类抗体已经经过 KO 验证。
包括遗传、正交和独立的抗体验证策略，此外还有捕获 MS 验证（抗体捕获的蛋白质随后由 MS 识别）和标记蛋白质的表达。标记蛋白被用作免疫细胞化学 (ICC) 等技术的标准，将它们产生的信号与测试抗体检测的内源性靶标进行比较。在这种情况下，重叠被认为表明了抗体的特异性。” 基于治疗的方法还丰富了抗体验证数据，例如通过证明检测到特定的翻译后修饰。
应用程序驱动的验证至关重要
仅仅因为抗体在一种应用中发挥作用，并不能保证它在另一种应用中也能发挥作用。在每种应用中，目标蛋白都会以不同的形式呈现。” “例如，在样品已被还原和变性的蛋白质印迹上检测到清晰条带的抗体可能无法在天然蛋白质印迹条件下或在 IHC 等应用中识别目标蛋白。这种性能差异并不构成“坏”抗体；相反，它强调了选择适合您的预期应用的抗体的重要性。
靶标特异性抗体只是免疫测定的一个组成部分。其他应考虑的因素包括样品制备方法、用于封闭和清洗的缓冲液类型、孵育时间和温度以及检测方法。在许多情况下，这些信息与在这些条件下进行测试时生成的结果一起包含在抗体数据表中。
验证从抗体制造商开始
虽然抗体验证在很大程度上被认为是制造商的责任，但研究人员越来越意识到他们也可以发挥重要作用。“抗体制造商在常见应用中测试抗体，并尽一切努力使他们的测试满足研究界的需求。全球范围内进行的研究总是会有所不同，因此必须在最终的实验室环境中进行进一步的测试，以优化条件并提供特定于应用的验证。
提供全面验证数据包的抗体可能只需要在实验室进行快速检查，而缺乏特异性证据的抗体可能需要更全面的分析，彻底审查抗体制造商的信息，并建议研究人员在寻找合适的抗体上投入的时间越多，他们在所选应用中评估抗体所需的时间就越少。
为您的研究选择正确抗体的技巧
· 寻找已在您选择的应用中经过测试的抗体，最好是在您将使用的同一物种中进行测试
· 查看可提供测试视觉确认的图像的抗体数据表，然后严格评估数据，例如，检查 ICC/IHC 中的信号分布和细胞定位是否与预期结果一致
· 尝试使用已通过多种方法验证的抗体
· 如果可能，选择在天然/基线水平表达靶蛋白的系统中经过验证的抗体
· 如果有的话，考虑使用经过 KO 验证的抗体
· 当靶标与其他家族成员同源性较高时，选择已被证明无交叉反应性的抗体
· 检查抗体数据表，了解测试过程中使用的实验条件、样品类型和对照的详细信息；使用这些作为在您自己的实验环境中进行进一步滴定或验证的指南
· 永远不要害怕向抗体制造商寻求建议
· 了解供应商的退货和换货政策 - 例如，了解他们为抗体将在规定的应用或物种中发挥作用提供的保证
· 请记住，寻找合适抗体所花费的时间越多，内部验证所需的时间就越少
