本方案仅用于研究目的，迈博睿生物的单体α-突触核蛋白，每批“用于制备预成型纤维的人α-突触核蛋白单体蛋白”都经过内部纯化和质量控制，以及外部验证，以确认致病性aSyn PFF的成功产生。α-突触核蛋白预形成纤维（aSyn PFFs）在体外或小鼠体内原代神经元培养中的应用方法和结果见参考文献[1-3]。
PFF产生的最佳条件
在生成aSyn PFF时，离子强度和pH值非常重要。这两个参数可能会影响PFF的形成，应在PFF诱导前进行分析。pH值应为~7.0，盐浓度应为约100mM NaCl。适当的超声波处理非常重要。该方案的参数设计用于蛋白和所列仪器的超声处理。为了获得最佳的接种效果，超声波处理后的原纤维长度应为50nm或更小。有关其他声处理参数的信息，请参阅参考文献[8]。
PFF的存储
PFF应分装到一次性试管中。aSyn PFF的等分试样可以在室温或-80°C下储存。PFF不应储存在4°C。如果等分试样保持在室温下，确保使用无菌成分来组装反应，以防止微生物污染。如果与下游应用兼容，也可以添加叠氮化钠作为防腐剂，但可能会导致细胞毒性。如果等分试样在-80°C下储存，必须采取预防措施避免不必要的冻融——将样品放在冰箱后面的盒子里，并尽量减少盒子在室温下打开的时间。冻融循环会通过分解原纤维和/或引起非特异性聚集来降解PFF。适当储存的PFF已被证明在-80°C下1-1.5年后会失去致病性。对于体内研究，强烈建议使用新鲜制作的PFF。
PFFS推荐的质量控制方案
建议进行各种生化和生物物理质量控制实验，以确保aSyn PFF的适当形成。每个实验的必要性取决于PFF生成协议的经验和PFF的指定用途。
实验目的 | 实验目的 | 实验示例 | 预期结果 |
验证纤维蛋白大小 | 首次使用该方案生成PFF时。在长期体内研究之前。 | 电子显微镜 | 大多数碎片≤50nm |
动态光散射 | 大多数碎片≤50nm |
验证胞吞能力 | 首次使用该方案生成PFF时。在长期体内研究之前。 | 小鼠原代神经元培养物的体外接种 | pS129病理学在aSyn PFF（但不是aSyn单体）孵育后在原代神经元中形成包涵体 |
验证纤维蛋白形成 | 每批新PFF或使用冷冻等分试样之前 | 硫黄素T测定 | 与单体相比，人类aSyn PFFs的读数高出20-100倍 |
沉淀分析 | 溶质和颗粒中蛋白质含量相等，或颗粒与溶质中蛋白质含量更多 |
外观 | 溶液应呈浑浊状态 |
α-突触核蛋白预成型纤维（PFFs）的预注射处理
概述：
•第一步：原纤维的形成
•第二步：质量控制
•步骤3：制备脑内注射用纤维
注意：我们强烈建议在涉及使用突触核蛋白原纤维的所有过程中，穿着适当的实验室服装，使用手套、口罩和护目镜。协议完成后，使用可以扔进生物危害垃圾桶的工作台纸。用10%SDS的水溶液清洗任何溢出物，然后在水中连续多次清洗。
步骤1。原纤维的制备。（时间约30分钟；纤维形成7天）[4-6]
试剂：
•1X不含钙和镁的PBS（Invitrogen 14190136）*
•25-30mg/mL纯化的重组aSyn蛋白。*该方案也适用于含有表位或亲和标签的aSyn（如Myc或polyHis）。然而，可能需要进一步的研究来确保缓冲液与特定修饰蛋白的组装相容。
•BCA试剂盒或Nanodrop装置
•硫黄素T（mabioway）：无菌水中的1 mM储备溶液
*=如果使用从迈博睿购买的“用于制备预成型纤维的人α-突触核蛋白单体蛋白”，起始蛋白浓度将为~5-7mg/mL。在这种情况下，您需要用10x的PBS替换1x PBS。
设备：
•台式离心机
•Eppendorf热力混合器R
•37ºC培养箱
•微型离心机盖锁
•凝胶加载头
•0.25 mL等分试管
•台式超速离心机
•用于硫黄素T测定的96孔板
•带激发滤光片450发射滤光片510的读板器
•-80ºC冷冻柜
关于内毒素：
对于蛋白质“用于制备预成型纤维的人α-突触核蛋白单体蛋白”，内毒素含量在产品说明书中报告。如果使用aSyn单体作为对照，内毒素单位（EU）应≤0.5 EU/mL，或在10mg/mL蛋白质时小于0.05 EU/mg。迈博睿内毒素去除试剂盒是一种可靠的内毒素去除方法。请注意，在此过程中您会丢失一些样本，清理后应重新测量蛋白质水平。内毒素与aSyn PFF结合较差，高速离心步骤将去除大部分存在的内毒素。
协议：
1.将“用于制备预形成纤维的人α-突触核蛋白单体蛋白”或其他重组aSyn单体的等分试样在冰上解冻。
2.在台式离心机中以最高速度（12000-15000xg）在4℃下离心10分钟。
3.保留上清液，避免任何可能已经沉淀的aSyn。测定样品的蛋白质浓度。
方法1（最推荐）：在纳米滴装置上通过A280测量蛋白质。使用比尔定律测量浓度（ε对突触核蛋白=5960 M−1 cm−1（人突触核蛋白）和7450 M−1 cm−l（小鼠突触核蛋白）。
方法2（不太推荐）：对样品进行BCA蛋白测定，以确定最终蛋白浓度。我们建议在3种蛋白质稀释液下进行测定（每种稀释液一式三份），以获得准确的测量结果。
4.通过将单体蛋白稀释到PBS中至终浓度为5mg/mL，将预形成的原纤维（PFF）组装在1.5mL微量离心管中。
示例：
如果蛋白质浓度为25mg/mL，将100μL蛋白质加入到1.5mL试管中的400μL PBS中。如果蛋白质浓度为6mg/mL（在10mM Tris、50mM NaCl、pH 7.6中），将44μL 40mM磷酸盐、230mM NaCl溶液添加到156μL单体aSyn样品中。这将导致最终缓冲液配方为~100 mM NaCl、~7.5 mM Tris和~10 mM磷酸盐，pH值为7.2-7.6。
注：由于PFF在经历冻融循环时，活性会随着时间的推移而下降，我们建议每管反应不超过500μL。
5.高速涡流3秒以混合内容物。
6.将微量离心机盖锁放在管盖上，以防止盖子打开。给试管贴上标签并注明日期。
7.置于37ºC的轨道振荡器中。
注意：建议将整个摇床放置在37ºC的培养箱中，因为大多数摇床不会加热管的顶部，从而导致冷凝。
8.以1000转/分的速度摇晃7天。在此期间，溶液应变浑浊。
9.将样本按照25μL/管等分试样。
10.将等分试样冷冻在干冰上，储存在-80ºC或室温下（请勿放置4ºC）。
11.在室温下解冻等分试样，并进行硫黄素T测定，以确认PFF的存在：
―将1mM硫黄素T原液在PBS中稀释至25μM终浓度（1:40稀释）
―在96孔板的每孔中吸取95μL的25μM硫黄素T。
―用移液管上下移取PFF进行混合，向含有硫黄素T的孔中加入2.5μL
―对于对照组，包括单独的2.5μLPBS和2.5μL单体aSyn。
―在室温下孵育2分钟至1小时。
―读取板（激发450nm，发射510nm）。
PFF的存在通常会导致读数比仅含有人类aSyn单体蛋白的样品高20-100倍。
12.纤维的存在也可以通过沉降来评估。
―在20μLPBS中稀释2μL 5mg/mL PFF
―在25℃下以100000 xg的速度在超离心机（如TLA-100）中旋转30分钟。
―去除上清液，在5X Loading缓冲液中稀释
―向颗粒中加入20μLPBS，用移液管上下移取几次，直至重新悬浮，在5X Loading缓冲液中稀释
―将样品在95℃下煮沸5分钟。
―在15%聚丙烯酰胺凝胶上运行等体积的上清液和颗粒部分
―用考马斯亮蓝染色，以显示条纹。
正确生成的PFF应导致上清液和沉淀物部分中蛋白质含量相等，或沉淀物中蛋白质含量高于上清液部分。如果上清液中的蛋白质比沉淀物中的蛋白质多，则PFF的形成效果不佳。
13.记录硫黄素T和沉淀测定的结果，以便进行批次比较。
注：硫黄素T和沉淀分析是验证一般纤维形成的基本生化分析。在实验室测试新的PFF生成方案或首次生成PFF时，建议进行更多的质量控制。在开始使用aSyn PFF进行长期体内研究之前，还建议进行更多质量控制。
步骤3。脑内注射用纤维的制备。手术前约1-2小时进行。这大约需要30分钟[3,5,7,8,9]
注：在体内或体外使用之前，强烈建议确定超声处理参数，以产生长度≤50nm的纤维（因为较长的纤维会导致毒性有限或缺乏毒性）。纤维长度可以使用电子显微镜或动态光散射进行验证。一旦确定了适当的超声处理参数，致使纤维长度≤50nm，应严格遵守这些参数。PFF样品体积或浓度的变化可能需要修改超声处理参数。
试剂：
•注射原纤维蛋白（PFF）可以在C57Bl/6、CD1、C57Bl6/Sv129和C57B/C3H小鼠诱导突触核蛋白病理学。
•无菌dPBS
•5 mg/mL aSyn PFFs（如步骤1中制备的）。使用前立即在室温下解冻。
设备：
•通风橱（BSL2）
•带1/8英寸尖端的声波发生器（Qsonic XL-2000）
•脑立体定位注射仪器
协议：
1.在通风橱或生物安全柜中执行所有超声波处理步骤。确保排气罩外部有管道，不会将废气再循环到实验室空间。
2.使用前立即在室温下解冻足够的5mg/mL PFF等分试样。建议再次测量蛋白质浓度（见方案步骤1，步骤3），因为冻融可能会改变蛋白质浓度。
3.将PFF加入含有适量无菌dPBS的无菌微量离心管中，将PFF稀释至所需浓度。请注意，PFFs是在dPBS中组装的。对于小鼠注射，推荐使用2-2.5mg/mL的PFF。
4.使用探头声波仪，在功率水平2下进行声波处理，共60个脉冲（每个脉冲约0.5秒）。每10-12个脉冲之间短暂暂停一次，以防止溶液过度加热并避免起泡。
注意：
水浴超声破碎也可以使用，条件需要进行个体优化。也适用于在添加/注射之前制备PFF（≤50nm）。水浴超声可以对封闭的管子进行超声波处理，避免气溶胶产生。在使用水浴超声处理代替探头超声波处理时要确保验证纤维长度≤50nm以获得适当的毒性。
5.关闭盖子并轻敲管子侧面，使管子侧面的任何液体现在都位于底部。外观是清澈无色，偶见小碎片。
6.经过超声波处理的PFF溶液静置1分钟。PFF悬浮液准备好。
7.使用前轻轻轻拂试管以混合内容物，并在两次注射之间上下混合均匀。制备好的样品最多放置4小时。超过期限需要新鲜制备。
注意：
如果使用aSyn单体作为对照，请确保内毒素单位（EU）接近或低于0.5 EU/mL。使用内毒素去除试剂盒大幅度减少内毒素残留。请注意，在此过程中，样本浓度会有损失，应在清除内毒素后重新测量蛋白质水平。
预期结果
注射后，aSyn病理学可检测水平发展所需的时间取决于所用动物的品系。例如，将PFF注射到纯合子aSyn Tg小鼠（M83系）中，在注射部位附近的3-4周内就会产生可见的病理学。在杂合小鼠中，使用相同的人类aSyn PFF时，时间范围通常为2-3个月，这表明病理学积累取决于表达水平。病理学aSyn应表现为神经元中磷酸化aSyn（即Ser129）阳性的神经元内和神经突起内含物。在星形胶质细胞中表达足够量aSyn的细胞系中，也可以看到神经胶质病理学。PBS处理和离心的aSyn单体对照脑应显示出最小的p-aSyn含量。其他抗体，如识别aSyn或aSyn错误折叠构象的抗体，也应该检测到内含物。
参考文献
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