PFF:超声处理PFF半定量分析

使用超声波均质机（VP-5S，TAITEC）在冰上对α-Syn原纤维进行超声处理，处理时间分别为0、5、15、30、60和180秒。用电子显微镜在10,000倍放大倍数下观察超声处理的原纤维（0.1 mg/ml）。通过照片测量原纤维长度，并计算长度分布。

探针超声波仪协议 （来自迈克尔·J·福克斯基金会，MJJF）

设备

通风柜（BSL2）

带 1/8 英寸尖端的超声波发生器（Qsonica XL-2000）

立体定位手术设置

协议

所有超声处理步骤均应在通风橱或生物安全柜中进行。确保通风橱外部有管道，不会将废气重新循环到实验室空间。

使用前，请将足量的 5 mg/mL PFF 在室温下解冻。建议再次测量蛋白质浓度（参见步骤 1，实验步骤 3），因为冻融可能会改变蛋白质浓度。

将 PFF 加入装有适量无菌 dPBS 的无菌微量离心管中，稀释至所需浓度。注意，PFF 是在 dPBS 中组装的。对于小鼠注射，我们通常使用 2-2.5 mg/mL 的 PFF。

使用探针式超声波仪，以2级功率进行超声处理，共计60个脉冲（每个脉冲约0.5秒）。每10-12个脉冲之间短暂暂停，以防止溶液过热并产生泡沫。

注：我们还使用精选的高能水浴超声仪（例如Covaris 和 Bioruptor 系统）测试了此方案。目前结果表明，这些系统也适用于在添加/注射前制备 PFF。这些系统可以对封闭的试管进行超声处理，在担心气溶胶产生的情况下更佳。

但是，使用水浴超声处理代替探针超声处理时务必谨慎，并确保原纤维长度≤50nm，以确保达到合适的毒性。

超声处理 0、5、15、30、60 和 180 秒后 α-syn 原纤维的电子显微镜图像。比例尺= 200 纳米

超声处理 0、5、15、30、60 和 180 秒后 α-syn 原纤维的长度分布

单体α-syn 和超声处理α -syn 原纤维的硫代黄素 S 荧光（硫黄素S主要用于体外检测PFF，其自身带有绿色荧光）

添加超声处理 α-syn 原纤维后单体 α-syn 的 ThT 荧光(硫黄素T通过与PFF结合后荧光显著增强，常用于PFF的特异性标记)

加入未经超声处理的 α-syn 原纤维（ 0 秒）或加入超声处理的 α-syn 原纤维（ 180 秒）各种稀释系列（ 1/1至1/60 ）后单体 α-syn 的 ThT 荧光。

超声处理前后制备预成型纤维 (PFF) 的步骤

1. 收到原纤维后，立即将其储存在-80C 下。

2. 超声条件设置以及计算需要原纤维量。

3. 在室温下解冻超声实验所需的量。

4. 将其分装到多个超声处理管中，并按照计划在不同的时间和设置下进行超声处理。

5. 通过 AFM/EM 记录这些超声参数，其中纤维长度 <50nm，或运行沉降分析以确认大多数纤维处于可溶相。

6. 解冻未经超声处理的纤维（收到后储存在-80C 的纤维）。

7. 在开始实验之前，以最佳超声处理设置进行超声处理（最佳情况是在使用前进行超声处理，但如果工作流程不可行，则替代方法是：以最佳超声处理设置进行超声处理，分装成所需剂量（体积）以供使用，冷冻分装以供日后使用。可以在注射前根据需要解冻超声处理后的产物）。

不同超声波仪类型的方法

Diagenode Bioruptor Pico Sonicator超声 

在1.5毫升的离心管中，以高功率处理100-300微升的样品，5个循环（30秒开启，30秒关闭）。设备参数范围为20-60kHz和25-210瓦。

建议在较高浓度下进行超声处理，然后再稀释。超声处理可以提高材料的溶解度和均匀性，从而更准确地进行移液和稀释。

建议所有人，最好的办法是针对您的实验室和特定的超声波仪，优化您的超声处理方案。您可以通过沉降分析寻找大多数纤维可溶解的超声处理参数，或者使用 AFM/TEM 确定纤维长度小于 50nm 时的超声处理参数。

探头超声波方案

设备

通风柜（BSL2）

带 1/8 英寸尖端的超声波发生器（Qsonica XL-2000）

立体定位手术设置

协议

所有超声处理步骤均应在通风橱或生物安全柜中进行。确保通风橱外部有管道，不会将废气重新循环到实验室空间。

使用前，请将足量的 5 mg/mL PFF 在室温下解冻。建议再次测量蛋白质浓度，因为冻融可能会改变蛋白质浓度。

将 PFF 加入装有适量无菌 dPBS 的无菌微量离心管中，稀释至所需浓度。注意，PFF 是在 dPBS 中组装的。对于小鼠注射，我们通常使用 2-2.5 mg/mL 的 PFF。

使用探头式超声波。使用2级功率进行超声处理，共计60个脉冲（每个脉冲约0.5秒）。每10-12个脉冲之间短暂暂停，以防止溶液过热并产生泡沫

注：也可以使用高能水浴超声仪（例如Covaris 和 Bioruptor 系统）测试了此方案。目前结果表明，这些系统也适用于在添加/注射前制备 PFF。这些系统可以对封闭的试管进行超声处理，在担心气溶胶产生的情况下更佳。

但是，使用水浴超声处理代替探针超声处理时务必谨慎，并确保原纤维长度≤50nm，以确保达到合适的毒性。

注意：超声波仪的品牌和型号多种多样，因此我们无法推荐一种特定的超声波处理方案。建议根据自己实验条件摸索超声条件。