抗体标记荧光素

N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯衍生物是最常用的蛋白质标记试剂之一。这里描述的方法可以适用于实际使用任何NHS荧光团。通常，荧光团与大分子如抗体共价结合，并充当用于测量大分子存在的报告分子。这些荧光标记的生物活性试剂适用于免疫荧光、流式细胞术和许多其他生物学应用。有几种广泛使用的染料以方便的形式提供。该方案可与任何胺反应性（例如PFP、异硫氰酸酯）荧光团衍生物一起使用。

试剂

抗体（1-10 mg/mL）

**确保待标记的抗体在pH为7-9的缓冲液中。如果抗体含胺缓冲液（如TRIS），必须进行缓冲液置换为PBS、碳酸盐、HEPES和硼酸盐等。

二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF）

G-25凝胶过滤树脂

N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素（NHS荧光素）

磷酸盐缓冲盐水（PBS）

设备

色谱设备（G-25上浆柱）或者脱盐柱

旋转器

搅拌板

方法

1.将抗体溶液转移到反应管中。

2.将10 mg/mL的NHS荧光素溶解在DMF或DMSO中。

3.向含有抗体溶液的试管中缓慢加入（滴加）适量的NHS荧光素。

**反应中使用的典型摩尔过量为5-15倍。实际使用量将取决于染料的分子量。

4.充分混合，将试管在室温下孵育1小时，或在4˚C下孵育4-12小时。请参阅故障排除。

5.在用于所需应用之前，使用G-25凝胶过滤去除未反应的NHS荧光素。请参阅故障排除。

问题排除

问题（步骤4）：沉淀物形成。

溶液：在抗体溶液中慢慢加入染料。

问题（步骤5）：使用标记抗体时，信号或反应性较差。

解决方案：•使用更少的染料，最大限度地减少抗原结合区的修饰。

•与不同氨基酸侧链的交联。

•NHS酯降解。获取新染料。