介绍：
小分子 pull-down 则是在 pull-down 的基础上，通过化学合成的方法将活性小分子进行修饰，连接上报告分子（如生物素），制备成小分子探针，通过探针分子上的报告分子（生物素）将其固定在与其亲和的固相支持物（如磁珠）上充当诱饵，与蛋白样品或细胞/组织裂解液共孵育，可捕获样品中与诱饵小分子互作的蛋白，接着通过洗涤或洗脱过程去除杂质，并将捕获的蛋白回收，进行 WB 检测分析或质谱鉴定。
蛋白-小分子互作在药物开发中扮演着至关重要的角色，它们是药物作用机制的核心。随着药物化学和分子生物学的发展，研究小分子药物与蛋白质相互作用的实验技术日益增多，为药物设计、药物筛选和药物作用机制的理解提供了强有力的工具。
图1 小分子 pull-down 基本实验流程图
实验流程：
1. 探针制备：活性小分子标记以及标记后的小分子活性鉴定。
2. 探针固定：探针分子固定在固相支持物上，如生物素标记的小分子可固定在链霉（亲和素）磁珠上。
3. 磁珠与蛋白样品孵育，并洗去杂蛋白。
4. 洗脱目的蛋白并进行 WB 检测或 SDS-PAGE 检测后进行质谱鉴定。
分类：
直接小分子 pull - down：通过生物素将小分子固定在磁珠上，与蛋白样品孵育后，直接捕获与小分子互作的蛋白，该方法不适用于瞬时结合、瞬时解离的小分子。
光交联法小分子 pull - down：先对药物小分子进行修饰，使其携带光交联基团，与细胞总蛋白孵育后，进行 UV 照射使小分子与靶蛋白共价连接，随后通过点击化学反应使小分子生物素化，再通过链霉亲和素磁珠对捕获的蛋白进行富集、洗涤、回收和检测。
邻近标记交联法小分子 pull - down：使用生物素化的小分子，在孵育过程中使用改造后的链霉亲和素磁珠，能通过特殊的酶催化反应，使小分子钓取到的靶蛋白与链霉亲和素之间产生共价连接，随后通过洗涤步骤洗去杂质，并回收得到的蛋白进行检测。
优势：
1. 相对于蛋白质芯片技术、小分子靶向蛋白分子显像技术、蛋白（多肽）展示文库筛选技术等，小分子 pull - down 实验操作简单，周期短，成本低廉。
2. 小分子与蛋白大多数为共价结合，特异性较强，结合紧密，实验结果复现率高，下游验证结合阳性概率较大。
3. 液质联用技术灵敏度可达pg级别，极其微量的蛋白能被分析出来。
参考文献：
1. Hsu CC, Xu ZG, Lei J, Chen ZZ, Li HY, Lin HK. Identification of myo-inositol-binding proteins by using the biotin pull-down strategy in cultured cells. STAR Protoc. 2022 May 14;3(2):101385. doi: 10.1016/j.xpro.2022.101385. PMID: 35600928; PMCID: PMC9117919.
2. Ma T, Tian X, Zhang BD, et al. Low-dose metformin targets the lysosome-AMPK pathway through PEN2. Nature 2022.
