蛋白质下拉分析-蛋白质下拉分析-西安迈博睿（Mabioway）生物科技有限公司

蛋白质下拉分析是一种体外亲和纯化方法，利用诱饵蛋白来富集与其相互作用的蛋白质。该方法可用于确认其他技术发现的现有蛋白质-蛋白质相互作用，或用于初步筛选以识别新的蛋白质-蛋白质相互作用。Profacgen为您提供蛋白质下拉服务，用于检测目标蛋白质可能存在的相互作用蛋白。

背景

Pull Down 实验是一种体外检测蛋白质相互作用的方法。常用的诱饵蛋白是纯化的 GST 标签蛋白。Pull Down 实验通常结合 SDS-PAGE 和质谱 (MS) 分析来鉴定相互作用蛋白，之后可进一步通过遗传学方法或 Western Blot 分析来确认直接相互作用。

特征

下图显示了下拉分析的特征。

下拉分析

Pull Down 试验与 Co-IP 的比较

下拉分析

Pull Down 检测的基本原理是利用与标签融合的蛋白（例如 GST 标签、His 标签和生物素标签）固定在亲和树脂上作为诱饵蛋白。当目标蛋白或细胞裂解物流过时，与诱饵蛋白（猎物蛋白）结合的蛋白会被捕获并“拉下”。通过随后的洗脱，并使用 Western Blot 或质谱 (MS)分析，可以确认预测的相互作用或发现未知的相互作用。迈博睿生物提供的 Pull Down 检测服务可以高效、特异性地验证预测的蛋白质相互作用或识别新的相互作用。

Pull Down 分析示意图

下拉分析图解

通过我们精心设计的实验方案，可以从细胞裂解、蛋白表达系统或体外转录翻译系统中获取诱饵蛋白和猎物蛋白。Pull Down 实验操作简便，节省成本。

我们的服务包括：

重组表达质粒的构建
诱饵蛋白表达与纯化
通过Western Blot或MS鉴定蛋白质-蛋白质相互作用
数据检索和生物信息学分析
结果提交

我们的优势：

完全定制化的高品质服务
严格的质量控制和一致的结果
周转时间短
市场最优价格
详细实验报告

实验设计

样本

您可以向我们提供粗组织样本或细胞样本。

标签选择

GST标签是诱饵蛋白纯化的最佳选择，也可以使用生物素标签或麦芽糖结合蛋白（MBP）标签。

His-tag 不可用，因为金属亲和珠会非特异性地结合蛋白质。

对照

将根据下表纳入所有必要的对照组，以验证交互特异性。

下拉分析

定制服务：

实验设计

我们将根据您感兴趣的蛋白质，例如其结构和功能域、细胞功能、酶或其他活性等，精心设计我们的实验方案。

特异性

有时需要对照样品来提高pull down实验的特异性。您可以向我们提供纯化的标签融合蛋白的一系列截短、缺失、突变，甚至来自其他基因的相关蛋白。

是否需要交叉链接

我们会根据您的需求，选择是否将交联（将标记蛋白与磁珠连接）步骤纳入整个流程。额外的交联步骤将使最终分析更加容易：因为标记融合蛋白与磁珠共价连接，不会出现在后续的凝胶电泳中。但请注意：交联过程中发生的化学修饰可能会导致特定蛋白质（尤其是酶）部分或全部生物活性的丧失。

样品处理的光学方案

针对不同的实验目的，我们对您的样品有不同的处理方法（细胞浆蛋白提取、外周蛋白提取或膜蛋白提取）。

Pull Down 分析流程图：

下拉分析流程图

下拉分析方案（以 GST 标记蛋白为例）

GST标签蛋白表达质粒的构建

1	根据客户提供的目标蛋白信息选择合适的表达载体。
2	将目的蛋白的DNA序列插入载体，生成重组表达质粒。
3	对重组质粒进行测序，确保序列没有突变。
4	将重组质粒转化大肠杆菌组分菌，筛选阳性克隆。

GST融合蛋白的表达与纯化

1	经阳性菌落验证后，提取质粒并转化大肠杆菌BL21进行目的蛋白的表达。
2	挑取单个菌落放入含有适当抗生素的LB培养基中，培养过夜。
3	扩大培养，达到指数期初期，加入诱导剂诱导GST融合蛋白表达（无诱导剂组作为对照）。
4	收获细菌细胞，并用冰冷的细胞裂解缓冲液重新悬浮。
5	将细菌悬浮液经过两次冻融循环。
6	在冰上进行超声处理以破坏细菌细胞并分解任何 DNA。
7	将适量的 DNase I 和 Triton X-100 加入细胞裂解物中，在 4°C 下旋转孵育 30 分钟。
8	将样品在 4 °C 下离心 30 分钟。同时，用少量裂解缓冲液处理谷胱甘肽 (GSH)-琼脂糖珠，离心并小心地去除上清液。
9	将裂解物的上清液加入预处理的珠子中，在 4°C 下旋转孵育 1 小时。
10	将混合物在 4°C 下离心 5 分钟，小心地从珠子中倒出上清液。
11	用洗涤缓冲液冲洗磁珠，4 °C 离心 5 分钟。重复 3-4 次。
12	将适量的珠子储存缓冲液加入珠子中，并储存于-20°C。珠子切勿冷冻，否则会破裂。为了避免这种情况，可以在珠子储存缓冲液中添加50%甘油。
13	进行 SDS-PAGE 并用考马斯亮蓝染色来分析纯化情况并定量与 GSH 珠结合的蛋白质量（包括诱导剂 (+)、诱导剂 (-)、上清液、沉淀物、流过物和珠子样品）。

当使用不同的 GST 融合蛋白作为诱饵蛋白时，需要对与珠子结合的蛋白质进行标准化。

目标蛋白质与珠子的交联

1	将所需体积的待交联GST融合蛋白珠加入适当大小的塑料柱中。用PBS缓冲液清洗柱子两次。
2	将 GST 融合蛋白珠和柱与交联剂交联，在室温下孵育 45 分钟并不断混合。
3	排空柱子。
4	将适量的猝灭缓冲液加入到柱子中，在室温下轻轻混合 10 分钟（封闭胺反应位点）。
5	在 4°C 下彻底清洗珠子，然后储存以备使用。

制备 GST 融合蛋白和组织裂解物

1	制备附着于 GSH-琼脂糖珠的重组 GST 融合蛋白，并在珠储存缓冲液中储存于 -20°C 下长达 6 个月。
2	准备组织裂解物（选择适合不同蛋白质位置的裂解方法：细胞质、外周或膜）。

确保裂解液中不含任何颗粒污染物，哪怕是极少量的颗粒污染物。污染会导致凝胶上出现大量非特异性蛋白质。如果存在非特异性蛋白质，务必通过高速离心去除。

使用 GSH 珠子预澄清裂解物

1	用洗涤缓冲液清洗一批（根据您的样品量）新鲜或回收的 GSH-琼脂糖珠，在 4°C 下离心 5 分钟，除去上清液并将珠子收集在最小体积的缓冲液中。
2	将清洗过的 GSH 珠子与组织裂解物混合，在 4°C 下孵育 30 分钟。（用清洗过的 GSH 珠子预清除组织裂解物，以去除裂解物中存在的内源性 GST 和非特异性结合蛋白）这将去除大部分内源性细胞 GST。
3	离心收集磁珠，小心地将上清液倒入冰上冷却的新管中。（预澄清的组织裂解液）
4	重复。

这对于富含内源性 GST 的组织裂解物（特别是特定组织的细胞溶质提取物和裂解物，例如睾丸或肝脏）尤其重要。

将组织裂解物与 GST 融合蛋白珠结合

将适量预澄清的裂解物加入相应体积的 GST 融合蛋白珠中。4 °C 旋转孵育 1 小时。

回收并清洗珠子

1	在 4°C 下离心裂解物和珠子混合物，小心地除去上清液。
2	用冰冷的洗涤缓冲液清洗珠子，离心并丢弃上清液。
3	重复5-6次。

洗脱蛋白质进行 SDS-PAGE 分析

1	将1×SDS上样缓冲液加入到珠子中，放入85°C水浴中5分钟。
2	将样品离心，存放在冰上以供立即使用或存放在冰箱中以供将来分析。
3	10°C 下过夜进行 SDS-PAGE 分析。（为了获得最佳蛋白质分辨率，凝胶必须足够长）
4	采用与质谱法兼容的适当技术对凝胶进行染色。

分析结果

1	比较实验组与对照组凝胶泳道间的条带，并参考相应数据库识别相互作用因子。
2	通过免疫共沉淀、酵母双杂交等方法进一步证实蛋白质-蛋白质相互作用。

在某些步骤中，可以使用旋转柱来提高检测速度、蛋白质回收率、重现性，并减少洗脱体积。

问题排除指南：

问题 1 (Q1)：在 MS 分析中，许多或所有条带都被鉴定为 GST。
可能原因：使用了过多的 GST 重组蛋白作为诱饵。
可能的解决方案：将 GST 融合蛋白与 GSH 磁珠交联，或减少 GST 融合蛋白的用量。

问题2： SDS-PAGE凝胶上四到五个20-30 KDa的蛋白质染色强烈，干扰了其他蛋白质的检测。
可能原因：组织裂解液中存在大量内源性组织GST，与GSH磁珠上剩余的游离谷胱甘肽位点结合。
可能的解决方案：用GSH磁珠严格预澄清裂解液；如果GST融合蛋白与磁珠交联，则需清洗磁珠2-3次，以特异性地洗脱GST。

Q3：与对照相比，未观察到目的蛋白的特异性结合蛋白。
可能原因 A：细菌产生的 GST 融合蛋白折叠不正确或未经翻译后修饰。
可能的解决方案 A：根据目的蛋白和细菌表达系统的文献更换表达系统，或使用非细菌表达系统，例如体外翻译，只要能获得足够的 GST 融合蛋白进行 pull-down 即可。
可能原因 B：裂解物的组织来源不适合目的蛋白。
可能的解决方案 B：更换组织来源：使用已知表达目的蛋白的组织，或筛选几种组织并同时进行 SDS-PAGE 分析，以比较不同组织的结合蛋白；将选定的组织扩大 10 倍；尝试从不同发育阶段的动物身上分离的组织。
可能原因 C：洗涤或结合缓冲液可能过于严格（盐、去垢剂浓度会影响结合）。
可能的解决方案 C：进一步稀释盐或去垢剂；将颗粒均质化至较小的体积，或使用具有不同特性的缓冲液进行组织提取。

问题4： GST融合蛋白磁珠在pull-down后洗脱出大量非特异性蛋白。
可能原因：不使用去污剂清洗时，疏水蛋白（主要是膜蛋白）可能会粘附在磁珠上。
可能的解决方案：先用含Triton X-100的洗涤缓冲液清洗磁珠，然后再用不含Triton X-100的洗涤缓冲液彻底清洗磁珠。

Q5：化学交联后，仍有GST融合蛋白从珠子上洗脱下来，干扰了pull-down实验。
可能原因A：交联反应不完全或效率低下，或交联剂降解。
可能的解决方案A：确保使用足量的交联剂；重新定量GSH珠子结合蛋白的水平；延长交联时间（最多2小时）；使用新鲜的交联剂；更换溶解性更好的交联剂。
可能原因B： GSH洗涤去除少量未交联的融合蛋白的力度不足或效率低下。
可能的解决方案B：交联后用珠子回收缓冲液清洗柱子，并让溶液通过。

Q6：未分离出相互作用蛋白。
可能原因A：相互作用较弱或短暂。
可能的解决方案A：减少洗涤次数或降低缓冲液的离子浓度。
可能原因B：猎物蛋白表达水平低。
可能的解决方案B：增加猎物蛋白的量。

请联系我们以了解有关我们的专业下拉分析服务的更多详细信息。