PROTAC通过劫持E3泛素连接酶的活性介导目标蛋白的降解,实现蛋白质的泛素化,进而被26S蛋白酶体降解。因此,检测蛋白质泛素化程度是PROTAC成功的关键步骤。
迈博睿生物提供多种泛素化分析技术平台:
免疫沉淀 (IP) 和蛋白质印迹法
这是测定靶蛋白泛素化最简单、最直接的技术。将靶蛋白从裂解物中免疫沉淀后,用针对泛素化分子的特异性抗体进行蛋白质印迹分析。该技术在测定内源性蛋白质的泛素化方面具有优势;如果蛋白质降解,抑制剂可以增强信号。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
解离增强镧系元素荧光免疫分析 (DELFIA) 是一种基于定量 ELISA 的方法,用于检测细胞中的蛋白质泛素化,并允许同时比较更多样本和实验条件。该技术基于捕获抗体和检测抗体对目标蛋白的夹心识别。将捕获抗体固定在固体表面后,将分析物(合适的细胞裂解物)在孔板上孵育。泛素化蛋白与检测抗体孵育时会产生特异性信号。
荧光偏振(FP)
该方法利用荧光分子追踪E1、E2和E3酶的进展以及分子量引起的荧光蛋白(FP)变化。在FP测定中,泛素化活性以并行方式观察,并且仅消耗荧光分子。该测定可用于小分子调节剂的高通量筛选(HTS),并可作为机械分析的替代方法。
质谱法(MS)
近年来,质谱 (MS) 已成为蛋白质组分析不可或缺的工具,例如分析蛋白质的翻译后修饰 (PTM)(例如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化),这些修饰可调控蛋白质活性。在质谱分析中,泛素化蛋白质经胰蛋白酶消化后,可利用与赖氨酸ε氨基偶联的肽段来追踪原始修饰位点。高效的肽段免疫纯化与灵敏的质谱检测相结合,已显著提高了泛素化鉴定的数量。
生物发光共振能量转移(BRET)
BRET 是一种基于邻近性的方法,可实时检测完整细胞中的泛素化。在 BRET 系统中,发光供体和荧光受体蛋白之间发生共振能量转移(蛋白质相互作用)。该系统依赖于供体和受体之间严格的分子邻近性,用于监测组成型和受调控型蛋白质相互作用。
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1. 明确需求,进行项目设计。
2.样品提交和质量控制。
3.测量和进度沟通。
4.数据分析及报告提交。
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