许多蛋白质可以在大肠杆菌中进行高水平表达。然而，原核表达系统无法表达许多真核蛋白质的正确折叠的功能形式，因此人们开发了各种基于真核的蛋白表达系统。
哺乳动物细胞表达系统是生产真核蛋白质的理想选择，因为它们能够进行翻译后修饰，这对于许多真核蛋白质的正确折叠至关重要。分泌性哺乳动物蛋白已在中国仓鼠卵巢细胞 (CHO)和人胚肾细胞 (HEK) 293中成功大规模生产。糖蛋白通常也在哺乳动物细胞中合成，因为像大肠杆菌这样的常见微生物宿主缺乏合成适当糖基形式的必要机制。尽管有大量细胞系可用，但目前近 70% 的重组蛋白治疗药物都是在 CHO 细胞中生产的。
传统上，哺乳动物细胞表达系统被认为是昂贵的，因为其转染试剂、专用培养基、耗材以及所需的专业人员成本高昂。然而，每升转染细胞的PEI试剂成本接近于零。HEK293T细胞易于培养，可在标准DMEM培养基（目前最便宜的真核细胞培养基之一）中生长。使用摇瓶可以降低实验成本。全程无菌技术和良好的技术支持确实至关重要助力实验成功。
这里我们介绍了我们经济高效且快速的基于哺乳动物细胞的表达系统，它不仅支持并行进行大量构建体的小规模筛选，而且还允许快速可靠地扩大毫克量重组蛋白的生产。
实验概要
瞬时哺乳动物表达系统的流程图
稳定表达细胞系开发流程图
使用哺乳动物表达系统进行重组蛋白表达的方案
以下协议可以作为使用 HEK293 细胞进行瞬时和稳定基因表达的参考。
1.质粒制备
| a | 制备用于细胞转染的纯质粒可以 i. 最大限度地提高转染效率 ii. 最大限度地减少内毒素导致的细胞死亡 |
| b | 准备 250 毫升细菌培养物。 |
| c | 使用无内切酶质粒大提试剂盒进行质粒制备。 |
2.表达质粒的线性化
| a | 推荐用于稳定的细胞系。 |
| b | 在非必要位置选择限制位点。 |
| 请注意，所选位置不应位于要表达的基因内或附近。 | |
| c | 您插入的基因很可能没有发生整合，这是不表达您插入的基因的抗性细胞生长的最常见原因。 |
3.转染
当贴壁细胞达到约 90% 汇合度时，即可实现最佳转染。
| a | 对于标准的 15 cm 组织培养皿（表面积约为 176 cm 2），需要 50 µg 质粒 DNA（需要根据不同的培养皿/培养瓶/培养瓶的表面积调整用量）。 |
| b | 将 DNA 与 PEI 原液（1 mg/ml）混合。短暂涡旋。 |
| c | 将溶液在室温下孵育，使DNA-PEI复合物形成。我们发现最佳DNA：PEI比例在1:1.5至1:2之间；但由于毒性较低，我们更倾向于1:1.5的比例。 |
| d | 在复合物形成期间，更换待转染板的培养基，将血清浓度降低至 2%。 |
| e | 最后，将 DNA-PEI 复合物加入培养皿中，然后短暂旋转以进行混合。 |
| f | 将细胞放入培养箱中。 |
在本节中，将包括阳性对照以监测转染效率。
4.转染效率评价
| a | 转染后2天。 |
| b | 计数GFP阳性细胞的百分比，通常为10-80％ |
| c | 或者，通过RT-PCR定量检测插入基因的mRNA表达。这需要收获至少10%的细胞。 |
5.收获细胞用于实验。
此外，10％的细胞可以返回培养瓶中，用于稳定细胞系的生成（下一步）。
6.建立稳定细胞系
| a | 转染后 48 小时添加含有选择剂的培养基。 |
| b | 抗性克隆的筛选和培养最多需要2周时间。当旧培养基开始变黄时，应更换培养基。 |
| c | 将可见的克隆菌落转移至 6 孔板中 i. 收集至少 6-12 个菌落 ii. 在拾取菌落之前，立即更换为含有抗生素的培养基（青霉素/链霉素和半强度选择抗生素，400 ug/mL 嘌呤霉素）。 |
| d | 使其达到约 80% 汇合度并维持抗生素浓度。 |
| e | 收获 90% 的细胞并评估插入基因的表达 i. RT-PCR（最适合基因序列变体） ii. 酶活性iii. 如果有合适的抗体，则进行蛋白质印迹分析。 |
| f | 将最佳克隆转移到 T-75 进行扩大生产。 |
7.纯化
| a | 重组蛋白很容易从条件培养基中纯化，纯化方案根据所用的亲和标签而有所不同。 |
| b | 我们通常使用以下 IMAC 批量程序从大规模培养中纯化 His 标记构建体。将培养基经 0.2 µm 滤膜过滤，用缓冲液稀释三倍，并加入 Tris 缓冲液调节至最终 pH 值。 |
| c | IMAC 纯化采用镍涂层螯合琼脂糖进行。 |
| d | 最后一轮凝胶过滤通常足以产生纯度超过 90% 的蛋白质。 |
| e |  |
上图显示在HEK293T细胞中通过共转染高效生成受体-配体复合物。细胞分别转染受体构建体（样品1）或配体（样品2，N-糖基化）或两种质粒的1:1混合物（1+2复合物和插图中的3号泳道）。
