实验介绍
共免疫沉淀（Co-IP）是测定蛋白质-蛋白质相互作用最常用的方法之一。它是依赖于抗体能够稳定且特异性地结合含有诱饵蛋白复合物的能力，同时可以将“抗体-诱饵蛋白-靶标蛋白”固定在固体基质上的方法。通过这种方法，就能够在天然条件下检测与特定蛋白质结合的未知蛋白质成员或配体。可用于研究蛋白质相互作用，蛋白质复合物鉴定及疾病机制的研究等。
实验原理是以细胞内源性目标蛋白为诱饵，通过已结合到Bead的靶蛋白的抗体与样本裂解液孵育，捕捉与抗体结合的靶蛋白复合物，将免疫复合物一起沉淀到磁珠上。洗脱去除未结合的杂蛋白并将靶蛋白以及结合蛋白释放出来。将获得的产物，再通过Western Blot或LC-MS技术，检测已知蛋白或其他蛋白。
图1 共免疫沉淀示意图
服务流程
实验流程
1. 样本收集，裂解细胞；
2. 裂解液分组（input，IgG及IP组）；
3. 免疫沉淀：磁珠与抗体结合：抗体与已预处理Protein A/G的Bead进行结合；捕获抗原：低温孵育结合“蛋白-蛋白复合物”。
4. 洗掉未结合的蛋白；
5. 纯化与免疫沉淀结合的蛋白质；
6. WB检测待测蛋白或者LC检测相关蛋白。
客户提供
1.实验样本: 细胞不少于2*10^7细胞/组；动物组织不少于0.6g/组；动物组织收集后液氮速冻，后保存于-80℃；干冰运输。
2. 抗体：与靶蛋白特异结合的IP级抗体（>25uL），待检测蛋白抗体
3. 样本信息
服务内容
服务项目 | 检测内容 | 实验周期 | 结果交付 | 其他 |
Co-IP WB | Western blot检测 样本中靶蛋白和待测蛋白的表达水平（可选做） | 3-4周 | Western blot检测结果： 样本中靶蛋白 样本中待测蛋白 | 包含蛋白提取定量，电泳，WB检测，两板胶两个目的蛋白 |
IP检测 WB检测 （分组为：对照组、实验组） | IP产物中靶蛋白WB检测结果 IP产物中待测蛋白WB检测结果 CoIP实验报告 | IP检测：每组包含Input，IgG，IP组） WB检测：两板胶 | ||
Co-IP MS | 样本质检 （WB检测靶蛋白）（可选做） | 7-8周 | Western blot检测结果： 样本中靶蛋白 | 包含蛋白提取定量，电泳，WB检测，一板胶一个蛋白 |
Co-IP捕获与靶蛋白有相互作用的所有蛋白（对照组、实验组） | IP检测过程 | IP检测：每组包含Input，IgG，IP组） | ||
IP产物的质谱检测及数据分析 （对照组、实验组） | 质谱检测结果及报告 互作蛋白筛选表格 | / |
结果示例图
CO-IP WB示意图：
结果解析：该实验通过COIP实验验证SKOV3癌细胞中FBW7与YTHDF2相互作用。分别将FBW7和YTHDF2作为诱饵蛋白，使用对应抗体进行免疫沉淀，WB检测结果显示样本中蛋白FBW7和YTHDF2有相互作用。
CO-IP MS示意图：
技术交流
问题 | 可能原因 | 解决方案 |
抗原没有免疫沉淀下来 | 样品中所含的抗原过少，抗体难以捕捉 | 采用WB检测IP前的样本裂解液中蛋白的表达和/或裂解效率；若本底表达较低，加大样品量 |
抗体无法结合抗原 | 更换抗体（新购买或者更换抗体识别表位） | |
IP 裂解/洗涤缓冲液中的成分干扰了抗原与抗体的结合 | 使用其它缓冲液进行免疫沉淀和漂洗 （例如，含有 0.5%CHAPS的TBS） | |
获得的蛋白量低 | 蛋白质被降解 | 加入蛋白酶抑制剂 |
所使用的磁珠量不够 | 提高捕获免疫复合物所使用的磁珠量 | |
样品中的目标蛋白量不够 | 提高抗原样品 | |
多条非特异条带 | 有非特异性的蛋白结合在磁珠上 | 在结合/漂洗和洗脱缓冲液中加入50-350mM NaCl。或者，在形成免疫复合物之前，将样品与Pierce蛋白A/G磁珠混合孵育（不加抗体），从而从样品中移除非特异性结合蛋白 |
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