E3泛素连接酶是泛素蛋白酶体通路中的关键酶。异常的E3连接酶与多种疾病有关，并被广泛认为是药物研发的热门靶点。因此，E3连接酶活性分析在生物化学研究和药物研发中都具有重要意义。
E3连接酶活性的检测通常利用其自身泛素化的能力，几乎所有E3连接酶都具有这一特性。我们这里提供了几种体外测定 E3连接酶活性的方法：
- 基于Western印迹的E3连接酶活性测定
E3泛素连接酶通过修饰连接酶中的特定赖氨酸残基进行自身泛素化。基于Western Blot的E3连接酶活性测定是一种传统的技术，利用特异性抗体分析分离的泛素化蛋白。
- 基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的E3连接酶活性测定
ELISA 检测是另一种检测蛋白质泛素活性的经典方法。该方法能够促进已知或假定的 E3 连接酶的泛素化，然后进行蛋白质印迹分析。此外，ELISA 还可用于体外 定量 测定血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解物、细胞培养上清液和其他生物体液中的泛素。
- 基于串联泛素结合实体 (TUBE) 的 E3 连接酶活性测定
由于纳米级亲和力，TUBE 可选择性地与多泛素链结合，从而能够在单泛素存在的情况下检测多泛素链。该检测方法可以快速且经济高效地表征和定量 E3 连接酶活性。
- 基于时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 的 E3 连接酶活性测定
TR-FRET 检测是一种定量测定 E3 连接酶反应产物 TUBE 与多泛素链结合的方法。FRET 是一种依赖于共振能量从供体荧光团到受体荧光团的近距离转移的技术。TR-FRET 利用镧系元素化学原理，可定性和定量地测定 E3 连接酶活性。该方法具有空间分辨率和供体/受体对的高灵敏度，可避免缓冲液、蛋白质、化合物和细胞裂解物等样品成分的背景荧光。
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