实验介绍
染色质免疫沉淀，通常被称为ChIP，是一种评估体内蛋白质与基因组DNA特定区域相互作用的技术。该技术通常用于研究DNA上由特定转录因子或组蛋白结合的位点，及观察各种组蛋白修饰（包括乙酰化，磷酸化或甲基化）的精确基因组位置。
实验原理是使用甲醛在体内将蛋白质与DNA交联，然后从交联的细胞和组织中提取染色质。收集的染色质通过超声或酶切被剪切，随后用于免疫沉淀，结合感兴趣的蛋白质特异性抗体，从而共沉淀和丰富交联的蛋白质相关DNA。交联过程可以逆转，蛋白质结合的最佳长度范围为200至1000 bp的DNA片段随后可以通过多种分析方法纯化和测量或测序。
ChIP 分析技术的优势在于其能够捕捉活细胞中特定蛋白质与 DNA 相互作用的瞬间，然后使用标准或定量 PCR 对这些相互作用进行定量。
图1 ChIP原理图
服务流程
实验流程
1. 样本收集，细胞交联。
2. 细胞裂解，将裂解液分组（input，IgG及IP组）
3. 免疫沉淀，
磁珠与抗体结合：抗体与已预处理Protein A/G的Bead进行结合；捕获抗原：低温孵育结合“蛋白-蛋白复合物”。
4. 洗掉未结合的蛋白
5. 纯化免疫沉淀中的核酸片段和蛋白。
6. 核酸进行qPCR或测序，蛋白可进行WB检测（可选做）。
服务内容
服务项目 | 服务内容 | 客户提供 | 实验周期 | 结果交付 | 备注 |
ChIP-qPCR | WB样本质检（检测样本中靶蛋白的本底水平）(可选做) | 1.实验样本: (细胞不少于2*10^7细胞，活细胞或已交联冻存于-80℃保存； 动物组织液氮速冻，冻存于-80℃保存，干冰运输，不少于0.5g/样） 2.IP级抗体及说明书：（>25uL） 3.目的基因及转录因子相关信息 | 5-6周 | WB条带: 样本中靶蛋白Western blot检测图 | 包含蛋白提取定量，电泳，WB检测 |
ChIP捕捉靶蛋白及其结合的DNA片段 （对照组、实验组） | 待测DNA序列的qPCR检测数据 ChIP实验报告 | IP检测：每组包含Input，IgG，IP组）
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ChIP-seq | WB样本质检（检测样本中靶蛋白的本底水平 (可选做) | 1.实验样本: (细胞不少于5*10^7细胞，活细胞或已交联冻存于-80℃保存； 动物组织液氮速冻，冻存于-80℃保存，干冰运输，不少于0.5g/样） 2.IP级抗体及说明书：（>25uL） 3.目的基因及转录因子相关信息 | 8-9周 | WB条带: 样本中靶蛋白WB检测图 | 包含蛋白提取定量，电泳，WB检测，一板胶一个蛋白 |
ChIP捕捉靶蛋白及其结合的DNA片段 （对照组、实验组） | IP检测过程 | IP检测：每组包含Input，IgG，IP组） | |||
Seq检测ChIP产物中的DNA片段并分析 | 质谱检测结果
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结果示例图
图2 ChIP-qPCR结果示意图
Ren Z,et al.2014. doi: 10.1186/1476-4598-13-84
结果解析：为了探究 E2F1 是否调控核因子 κB（NF-κB）与细胞间黏附分子 - 1（ICAM-1）启动子上的核因子 κB（NF-κB）结合位点的结合，进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验（图2 A 和图2 B）。分别用 E2F1 抗体、p65 抗体或正常 IgG 对 DU145/sh-Con 和 DU145/sh-E2F1 细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀。在常规 PCR（图 A）和实时荧光定量 PCR（图2 B）中，使用了位于 ICAM-1 启动子内 κB 结合位点两侧的引物进行q-PCR。以CDC2启动子内 E2F1 结合位点的 PCR 作为检测 E2F1 结合活性的阳性对照。结果表明，E2F1 并不直接结合 ICAM-1 启动子内的NF-κB位点。
然而，当 DU145/sh-E2F1 细胞中 E2F1 缺失时，NF-κB 的结合显著增加。这些数据有力地表明，E2F1 可能充当 NF-κB p65 的隔离物，阻止其与 ICAM-1 启动子结合。因此，敲低E2F1 会增加 NF-κB 与 ICAM-1 启动子的结合，从而导致 ICAM-1 转录的上调。
ChIP-seq
图3 ChIP-seq结果图
技术交流
问题 | 可能原因 | 解决方案 |
总input样本中无 PCR 信号或信号低 | PCR 扩增条件需优化 | 优化 PCR 条件 |
检查引物设计 | ||
添加到 PCR 反应中的样本 DNA 量不足 | 增加添加到 PCR 反应中的样本 DNA 量 | |
细胞核未完全裂解 | 通过显微镜观察细胞核的超声处理情况，确保完全裂解 | |
阳性对照免疫沉淀（IP）样本中无 PCR 信号或信号低 | 免疫沉淀（IP）反应中的染色质量不足 | 每次免疫沉淀（IP）至少使用 25μg 染色质 |
抗体孵育时间不足 | 将抗体孵育过夜 | |
细胞核未完全裂解 | 通过显微镜观察细胞核的超声处理情况，确保完全裂解 | |
目标丰度低 | 添加更多染色质或磁珠（30 微升） | |
阳性和阴性对照免疫沉淀（IP）样本的 PCR 信号相同 | 免疫沉淀（IP）中添加了过量的染色质或抗体 | 减少染色质或抗体的添加量 |
添加到 PCR 反应中的样本 DNA 量不足 | 向 PCR 反应中添加更多的样本 DNA | |
实验性免疫沉淀（IP）样本中无 PCR 信号或信号低 | 免疫沉淀（IP）中添加的抗体量不足 | 向免疫沉淀（IP）中添加更多抗体 |
抗体在免疫沉淀（IP）中不起作用 | 验证该抗体是否适用于染色质免疫沉淀（ChIP）或免疫沉淀（IP）应用，并且是否已正确处理和储存 |
西安迈博睿生物（Mabioway）在染色质免疫共沉淀(ChIP)领域研究多年，我们拥有专业的实验技术人员、完善的抗体实验设备、熟练的实验技术，可以为客户提供染色质免疫共沉淀实验技术服务。如您对染色质免疫共沉淀实验感兴趣或者需要技术支持，请您与我们联系，根据需求提供方案和报价，我们免费提供项目咨询及评估。
