山羊 (Capra hircus, goat) 是一种重要的反刍动物,是研究和生物医学应用抗体试剂重要来源,也是农业中具有经济价值的动物,每种山羊都有特定的体重范围,大型品种的公山羊(如波尔山羊)体重超过 140 公斤,小型母山羊体重为 20-27 公斤。在每个品种中,不同的品系或血统可能有不同的公认尺寸。
山羊天生有两个角,其形状和大小取决于品种。与牛不同,山羊未能成功培育成可靠的无角山羊,其中决定性别的基因和决定角的基因是紧密相连的。公山羊和母山羊都可能长有胡须,许多种类的山羊(最常见的是奶山羊和波尔山羊)可能有肉垂,颈部两侧各垂着一个。
与其他哺乳动物反刍动物一样,它们是偶蹄类动物。雌性山羊的乳房有两个乳头。山羊是二倍体,有两组 30 条染色体。妊娠期大约为 150 天。通常生双胞胎,单胞胎和三胞胎也很常见。
山羊在 3-15 个月大时进入青春期,具体时间取决于品种和营养状况。许多饲养者倾向于推迟配种,直到母羊长到成年体重的 70%。
图1 山羊
山羊与绵羊关系密切,属于羊亚科。它是与人类和啮齿动物(例如小鼠)关系较远的典型物种之一。山羊长期以来被用于生产抗体产品,特别适合大规模生产。山羊拥有足够多的抗血清,约为小动物个体的 7-8 倍。此外,其血清中含有超过 20 mg/mL 的总 IgG,与其他替代品相比丰富 2-3 倍。与其他较小的宿主物种(例如兔子和老鼠)不同,由于山羊血清产量巨大,可以从单个免疫山羊中获得大量抗体。因此,山羊被认为是大规模生产抗体的理想宿主,具有高稳定性和低成本。山羊抗体已被证明是一种强大的工具,可用于各种科学研究应用,例如免疫诊断试剂盒、宿主细胞蛋白 (HCP) 测定和效力测定、通用型二抗等。
图2 对山羊、绵羊、牛、小鼠、人类和猪的假定 IGHG 氨基酸序列进行系统发育分析
正常成年山羊血清总 IgG 浓度确定为 19.97 ±1.55 mg/ml,IgG1 为 10.92± 0.84 mg/ml,IgG2 为 9.07±0.78 mg/ml。未发现与季节相关的显著变化,但浓度变化,尤其是血清 IgG1 的变化发生在产前和产后。山羊初乳中的 IgG 浓度比血清中的浓度高出约 2.4-2.8 倍,IgG1 亚类占 95-98%。在免疫反应期间,IgG1 急剧上升,而 IgG2 浓度的变化不太明显。两种 IgG 亚类在血凝反应中都较为活跃,尽管 IgG1 的效率高出 22-52 倍。与所有反刍动物一样,只有 IgG1 在经典测试中固定补体。不同 IgG 亚类在诱发 PCA 反应的能力上存在差异。IgG2 亚类仅在同源物种中活跃,而 IgG1 则在异源物种中活跃。嗜细胞活性与 IgG2 亚类有关。
山羊多克隆抗体制备流程:
(1)抗原制备
注射抗原的量决定了引起的免疫反应强弱。抗原过多或过少都可能引起抑制、致敏、耐受或其他不必要的免疫调节。抗原的量取决于抗原的固有特性、抗原是否纯化或者是抗原混合物中的一种成分、所用的佐剂以及注射的途径和频率。
一般来说,需要微克到毫克数量的蛋白抗原与佐剂结合才能在实验动物中引发高滴度抗体反应,对于山羊一般免疫剂量为 250-5000μg。
a.根据抗体用途设计制备抗原。
b.尽可能保持抗原(抗原/佐剂混合物)生物学活性。
(2)动物种类的选择
通常使用6-7月龄的山羊。传统上,雌性动物用于生产 PAb,雌性比雄性动物更容易群居,更温顺、攻击性更低。或者阉割过的雄性山羊也是常用的选择。
(3)佐剂的选择和制备
弗氏完全佐剂 (FCA)、弗氏不完全佐剂 (FIA )。FCA 常用于生产多克隆抗体,因为几乎所有类型的抗原都能诱导出高抗体效价。
(4)注射途径:
a.油性佐剂和粘稠凝胶佐剂抗原:皮下 (sc)、皮内 (id)
b.可溶性抗原或水性佐剂抗原:皮下 (sc)、皮内 (id)、肌肉内 (im)和静脉内 (iv)
(5)注射剂量:
a.油性佐剂和粘稠凝胶佐剂混合抗原:皮下 (sc)可以注射0.5ml、皮内 (id)可以注射0.05ml
b.可溶性抗原或水性佐剂混合抗原:皮下 (sc)可以注射2ml、皮内 (id)可以注射0.05ml、肌肉内 (im)可以注射2ml、腹膜内 (ip)不推荐,静脉内 (iv)可以注射30ml
(6)注射部位数量:
使用抗原乳化剂时一般进行4-6个位点注射,最好后续在相同位点进行抗原/佐剂混合物注射
(7)加强免疫:
两次加强免疫之间动物可以间隔数月,在抗体滴度达到稳定水平或开始下降后可以加强免疫。当首次免疫不使用缓释佐剂时,抗体滴度通常在免疫后 2 至 3 周达到峰值。当使用缓释佐剂时,加强免疫可能在第一次免疫后至少 4 周进行免疫,一般进行两到三次加强免疫
(8)抗体效价监测:
一般进行2-3次抗体效价检测,评估免疫效果,安全采血量150-400ml
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